Часы работы з 08:00 до 17:00

EFFECT OF IMMUNOMODULATOR FROM
LACTOBACILLUS DELBRUECKII ON THERAPEUTIC EFFICACY
OF CYCLOPHOSPHAMIDE IN MICE WITH LEWIS CARCINOMA

T.A. Meniok, I.M. Voyejkova, O.Y. Yudina,

V.5. Mosienko, L.N. Shynkarenko, Z.D. Savtsova*

R.E. Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology,
National Academy of Sciences of Ukraine, 03022, Kyiv, Ukraine

ВЛИЯНИЕ ИММУНОМОДУЛЯТОРА ИЗ LACTOBACILLUS
DELBRUECKII
НА ТЕРАПЕВТИЧЕСКУЮ ЭФФЕКТИВНОСТЬ
ЦИКЛОФОСФАМИДА У МЫШЕЙ С КАРЦИНОМОЙ ЛЬЮИС

Т.А. Менек, И.М. Воейкова, О.Ю. Юдина,
В.С. Мосиенко, Л.Н. Шинкаренко, З.Д. Савцова*

Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии

им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев, Украина

Results of investigation of peripheral blood, lymphoid organs, and intestinal epithelium showed that blasten (immunomodulator from Lactobacillus Delbrueckii) was capable of preventing cyclophosphamide-induced cytosuppression. Moreover, blasten augmented the therapeutic efficacy of cyclophosphamide in mfce with Lewis carcinoma. This augmentation manifested itself both in an enhanced tumor growth inhibition and in a lower metastasizing.

Key Words: immunomodulator from Lactobacillus Delbrueckii, Lewis lung carcinoma, cyclophosphamide, cytosuppression, therapeutic effect.

Результаты исследования периферической крови, лимфоидных органов, кишечного эпителия свидетельствуют о том, что иммуномодулятор из Lactobacillus Delbrueckii (бластен) эффективно предотвращает цитосупрес- сивное действие циклофосфамида. Кроме того, применение исследуемого препарата повышало терапевтичес­кую эффективность циклофосфамида у мышей с карциномой легких Льюис, что проявлялось как в усилении торможения роста опухоли, так и в снижении метастазирования.

Ключевые слова: иммуномодулятор из Lactobacillus Delbrueckii, карцинома легких Льюис, циклофосфамид, цитосупрессия, терапевтический эффект.

Received: September 14, 2000.

Correspondence. Fax: (380-44) 267-1656; E-mail: savtsova@onconet.kiev.ua Используемые сокращения: ИИМ — индекс ингибиции мета­стазирования; ИМП — иммуномодулятор микробного проис­хождения; НСТ-тест — тест определения активности моноци­тов с помощью гистохимического красителя — нитросинего тетразолия; ФНО — фактор некроза опухоли; ЦПА — цитохи­мический показатель активности; ЦФ — циклофосфамид.

Несмотря на постоянное совершенствование средств и методов поддерживающей (сопровож­дающей) терапии, цитосупрессия, индуцирован­ная облучением и/или химиотерапевтическими препаратами, продолжает оставаться серьезной проблемой, ограничивающей эффективность ком­бинированного и комплексного лечения больных онкологического профиля [1]. Наряду со специфи­ческими кроветворными (колониестимулирующи­ми) ростовыми факторами в качестве средств поддерживающей терапии внимание исследова­телей продолжают привлекать также неспецифические вещества,

которые могут стимулировать механизмы физиологической защиты системы гемо-, иммунопоэза от цитотоксических влияний, в частности, активировать индукцию ФНО, ИЛ-1 и ИЛ-6 – цитокинов, которые запускают “цитокиновый каскад”. Это обеспечивает защиту кро­ветворных клеток, обновление пула стволовых клеток, мобилизацию пула дозревающих и ре­зервных клеток костного мозга, восстановление количества циркулирующих клеток периферичес­кой крови [2]. В последнее время в качестве неспецифических средств коррекции цитосупрессии все более активно исследуются препараты природного происхождения: пробиотики, продукты синтеза микроорганизмов-симбионтов, фитопрепараты, эмбриональные экстракты [3].

Как показали доклинические исследования нового иммуномодулятора из Lactobacillus Delbrueckii (бластен, НПЦ Энзифарм, Украина) [4], этот препарат до­статочно эффективно стимулирует in vitro и in vivo продукцию моноцитами ФНО и ИЛ-1, способствует восстановлению гемопоэза при фракционированном гамма-облучении [5,6]. Положительное влияние пре­парата на содержание лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови было обнаружено и при про­ведении 1-Н фазы клинических испытаний при луче­вой, химиолучевой и комбинированной химиотера­пии больных раком молочной железы или раком лег­кого (II, III, IV стадии заболевания) [7].

Показано, что высокие и низкие дозы многих иммуномодуляторов по-разному влияют на популяции моноцитов и лим­фоцитов [8]. Известно также, что при использовании иммуномодуляторов в высоких дозах (как разовых, так и суммарных при многократном частом введе­нии) фаза гиперактивации иммунных реакций может сменяться их резким снижением (по сравнению даже с исходным уровнем) [5]. Учитывая это, задачей дан­ного исследования явилось экспериментальное обо­снование оптимальных доз и схем применения ИМП как препарата сопровождения при химиотерапии зло­качественных опухолей.

 

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение влияния ИМП на химически индуцированную цитосупрессию проведено на мышах ли­нии С57В1. Методом случайной выборки животных разделили на 4 группы: 1 -я — контрольная (интакт­ные мыши), 2-я — мыши, которым внутрибрюшин­но вводили ЦФ в дозе 200 мг/кг;

 

3-4-я — живот­ные, которые за 1-2 ч до введения ЦФ получали ИМП (внутрибрюшинно) в дозах 6,7 и 0,07 мг/кг соответственно.

Через 10 сут у животных каждой группы определяли количество эритроцитов и лейкоцитов в периферической крови, число клеток в лимфоидных органах, субпопуляционный состав лимфоцитов в периферических лимфоузлах, коли­чество макрофагов, выделенных по стандартной методике из брюшной полости, и их активность в НСТ-тесте [9]. Также исследовали митотическую активность эпителия крипт тонкого кишечника мышей каждой группы [10]. Математическую обработ­ку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента [11].

 

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Введение ЦФ не вызывало существенных изме-нений эритропоэза, но приводило к статистически достоверному (Р < 0,05) снижению таких показате-лей лейко- и иммунопоэза, как количество лейко-цитов в периферической крови; количество клеток в вилочковой железе и в периферических лимфо¬узлах; количество лимфоцитов на 1 мг массы этих органов и селезенки. Относительное содержание зрелых Т-лимфоцитов в периферических лимфо¬узлах снижалось, а относительное содержание зре¬лых B-лимфоцитов имело тенденцию к повышению (Р = 0,05). Относительное содержание бластов и больших лимфоцитов существенно возрастало, что можно трактовать как компенсаторную реакцию иммунной системы на лимфотоксическое воздей-ствие ЦФ [12]. Абсолютное содержание в перифе-рических лимфоузлах зрелых лимфоцитов было существенно сниженым, что отражает токсичность ЦФ для Т — (супрессоры, хелперы, цитотоксические лимфоциты), В-, ЕК-клеток [12, 13] и может нега¬тивно влиять на интенсивность противоопухолевых иммунных реакций. Отмечена тенденция к умень-шению количества макрофагов, однако их жизне-способность была достоверно сниженой. Активность в НСТ-тесте после воздействия ЦФ практически не изменялась (табл. 1).

 

Таблица 1. Влияние ИМП на некоторые показатели мышей линии С57В1, получавших ЦФ (200 мг/кг)

Показатель Группа животных
  Интактный контроль Контроль ЦФ ИМП (6,7 мг/кг) + ЦФ ИМП (0,07 мг/кг) + ЦФ
Количество лейкоцитов в крови (*106/мл) 13,80 ±1,30 8,50 ± 2,001 10,20 ±2,20 11,60 ±2,50
*Количество клеток (* 106) в:  
вилочковой железе 74.30 ± 20.40

2,40 ± 0,20

19.00 ± 6.002

1,40 ± 0,301

19.20 ±3.402

1,60 ±0,101

21.80 ± 7.502

1,20 ±0,101

селезенке 107,70 ±20,10

1,54 ±0,05

127,30 ±27,50

0,97 ± 0,071

199,30 ± 0,701, 3

0,96 ±0,101

247,30 ± 15,101,3,5

1,20 ±0,051,3,5

лимфатических узлах 8.40 ±1,00

0,70 ± 0,07

4,10±0,201

0,40 ± 0,03

11.30 ± 2.303

0,50 ± 0,031

9.80 ± 2.604

0,40 ± 0,051

** Содержание в лимфатических узлах:  
Т-лимфоцитов 74,00±2,31

6,21±0,60

67,30 ±1.091

2,75 ± 0,401

Не иссл. 69.70 ± 2.83

6,83 ± 0,283

В-лимфоцитов 22,50±2,08

1,82±0,15

27,20 ±1,45

1,12 ± 0,202

Не иссл. 24,30 ±1,86

2,38 ± 0,283

бластов и больших лимфоцитов 2,80±0,60

0,24±0,5

4.80 ± 0.441

0,20 ± 0,02

Не иссл. 4.50 ± 0.872

0,44 ± 0,083

Характеристики макрофагов:  
общее количество (*106) 4,50±1,70 1,20 ±0,40 0,90 ± 0,202 1,70 ±0,205
% жизнеспособных клеток 96,70±0,50 86,30 ± 0,601 84,20 ± 4,001 91,60 ± 2,604

 

ЦПА (%) 5,00±0,58 6,00 ±1,15 4,70 ± 0,67 4,00 ±1,00
Митотический индекс клеток кишечного эпителия (%) 4,50±0,40 1,90 ±0,301 4,00 ± 0,904 3,50 ± 0,503

 

1 2 Р < 0,05; 0,05 < Р < 0,1 соответственно при сравнении с интактным контролем;

3 4 Р < 0,05; 0,05 < Р < 0,1 соответственно при сравнении с контролем ЦФ;

5 6 Р < 0,05; 0,05 < Р < 0,1 соответственно при сравнении групп животных, получавших ИМП в разных дозах;

* в числителе — количество клеток на орган, в знаменателе – количество клеток на 1 мг массы органа;

** в числителе — относительное содержание лимфоцитов разных субпопуляций (%), в знаменателе — абсолютное содержание лимфоцитов разных субпопуляций (106).

 

Введение ИМП предотвращало уменьшение количества лейкоцитов в периферической крови, уменьшало проявление лимфотоксического дей ствия ЦФ, способствовало усилению компенсатор­но-восстановительных реакций организма. Прояв­лением последних является, в частности, стиму­ляция миграции лимфоцитов в периферические лимфоидные органы: в лимфатических узлах коли­чество клеток практически не отличалось от ана­логичного показателя у интактных мышей, в селе­зенке — превышало таковой. Относительное и абсолютное число зрелых Т- и В-лимфоцитов в периферических лимфоузлах не отличалось от нормальных показателей, что свидетельствовало о положительном влиянии ИМП на восстановле­ние Т- и В-звеньев системы иммунитета. Повы­шение не только относительного, но и абсолютно­го содержания в лимфоузлах бластов и больших лимфоцитов является еще одним свидетельством высокого уровня компенсаторной реакции организ­ма животных 3-й и 4-й групп. У мышей, которым вводили 6,7 мг/кг ИМП, количество макрофагов, выделяемых из брюшной полости, и их жизнеспо­собность оставались сниженными. Введение ИМП в дозе 0,07 мг/кг предотвращало снижение жизне­способности макрофагов. Таким образом, приве­денные результаты свидетельствуют, что ИМП из Lactobacillus Delbrueckii может эффективно коррек­тировать негативное влияние химических цитоста­тиков на гемо- и иммунопоэз.

Введение ЦФ приводило также к существенно­му снижению митотического индекса клеток ки­шечного эпителия, что является одним из типич­ных проявлений побочного (органотоксического) действия цитостатиков (см. табл. 1). При введении ИМП в обеих исследуемых дозах и ЦФ митотичес­кий индекс клеток кишечного эпителия практически не отличался от такового у интактных мышей. Та­ким образом, ИМП из Lactobacillus Delbrueckii за­щищает не только от миелотоксического, но и от органоцитотоксического действия ЦФ, в частности, снижает негативное влияние последнего на мито­тическую активность (восстановление) клеток ки­шечного эпителия. Последнее обстоятельство представляется особенно важным, поскольку се­годня, благодаря открытию, разработке и внедре­нию в клинику рекомбинантных КСФ человека [14, 15], аутотрансплантации стволовых гемопоэтичес­ких клеток периферической крови [16], развитию аллогенной трансплантации клеток костного моз­га [17] можно устранить гематологическую токсич­ность химиотерапии, однако органотоксичность или прямое цитотоксическое действие последней на организм больного остаются основными дозоли— митирующими факторами при назначении интен­сивной и высокодозовой терапии [18].

Известно, что практически все противоопухо­левые препараты негативно влияют на систему им­мунитета (хотя механизмы такого влияния и клет­ки-мишени для препаратов разных групп могут ва­рьировать) [1].

Особо следует подчеркнуть, что весьма чувствительной к большинству химиопрепаратов, в том числе и к ЦФ, является популяция ЕКК [13]. Снижение активности этих клеток мо­жет сопровождаться усилением метастазирования, что практически перечеркивает эффективность специфической противоопухолевой терапии.

Учитывая изложенное, а также выявленную возможность как положительной, так и отрицательной модуляции активности ЕКК при применении разных доз и схем введения ИМП [5], представлялось целесообразным изучить его влияние на противоопухолевую эффективность ЦФ на эксперименталь­ной модели метастазирующей опухоли — карци­номы легких Льюис. Исследование проведено на мышах линии C57BI, которых после перевивки опу­холевых клеток делили на 4 группы: 1-я – мыши, которым вводили ЦФ (60 мг/кг) внутрибрюшинно на 3-и и 7-е сутки после перевивки опухоли;

 

2-я — мыши, которые получали ЦФ по такой же схеме и трехкратно (на 3-и, 7-е, 11 -е сутки внутрибрюшинно) — ИМП в дозе 6,7 мг/кг; 3-я — мыши, получавшие по аналогичным схемам ЦФ и ИМП в дозе 0,09 мг/кг; 4-я — животные, которым на 3-и, 7-е, 11 -е сутки вводили внутрибрюшинно изотонический раствор натрия хлорида в тех же объемах (0,2 мл) — контроль. Животным 2-й и 3-й групп ИМП вводили за 30 мин до ЦФ. На 27-е сутки оценивали торможение роста первичных опухолей, частоту и интенсивность метастазирования, а также рассчитывали ИИМ [19].

Установлено, что ЦФ в низкой терапевтической дозе (60 мг/кг) ингибирует рост первичных опухолей на 24%, а метастазирование — на 51%, при этом частота метастазирования и его интенсивность снижались в сравнении с контролем в 1,4 раза (табл. 2). Совместное применение ЦФ и ИМП в дозе 6,7 мг/кг повышало терапевтический эффект: торможение роста опухоли составило 60%, ИИМ — 61%. При использовании ИМП в дозе 0,09 мг/кг эффект был еще более выражен: торможение роста опухоли — 70%, ИИМ — 71%.

Таким образом, совокупность полученных данных обосновывает целесообразность использования иммуномодулятора из Lactobacillus Delbrueckii в качестве препарата сопровождения при химиотерапии злокачественных опухолей, причем оптимальными оказались его сверхнизкие дозы (0,07-0,09 мг/кг).

Таблица 2. Влияние комбинированной терапии ЦФ и ИМП на рост и метастазирование карциномы Льюис у мышей линии С57В1

Препарат Доза, мг/кг Торможение роста опухоли, % Частота метастазирования, % Среднее количество метастазов на мышь ИИМ, %
ЦФ 60 24 60,0 9,0 ± 0,51 51
ЦФ+ИМП 60+6,70 60 50,0 8,5± 0,51 61
ЦФ+ИМП 60+0,09 70 44,4 7,1± 0,21,2 71
Контроль   ––– 87,5 12,5± 1,2 –––

 

1Р < 0,05 при сравнении с контролем;

2Р < 0,05 при сравнении с ЦФ.

 

ЛИТЕРАТУРА

  1. Касьяненко И.В. Химиотерапевтический метод лечения онкологических больных. В: Справочник по онкологии. Киев: Здоров’я, 2000: 66-76.
  2. Возианов А.Ф. Бутенко А.К. Зак К.П. Цитокины. Биологические и противоопухолевые свойства. Киев: Наук думка, 1998. 320 с.
  3. Руководство по иммунофармакологии. М.М. Дейл, Дж.К. Формен, ред. Москва: Медицина, 1998. 332 с.
  4. Патент 20509, А61К 35/74, С12 1/20. Біотехнологічний спосіб одержання імуномодулюючого препара­ту. Болоховська В.А. Волкова М.Ю. Воспяков В.Г. Дани­ленко В.С. Латишевська Г.В. Мартинюк Н.Б. Мосієнко В.С. Мосієнко М.Д. Савцова З.Д. Сойченко В.В. Шин­каренко Л.Б. Щеглова НА. — АТНБЦ “Ензифарм”, и А. — № 95083935; заявл 28.08.95.; публ 15.07.97.
  5. Мосієнко В.С. Мосієнко М.Д. Савцова З.Д. Да­ниленко В.С. Волкова М.Ю. Шинкаренко Л.М. Щегло­ва Н.А. Воспяков В.Г. Свідро О.В. Меньок Т.А. Блас­тен – новий вітчизняний імуномодулятор біологічного походження. Журн АМН України 1999; 5: 79-86.
  6. Мосиенко ВС, Савцова ЗД, Менек ТА, Мосиен­ко МД, Касьяненко ИВ, Шинкаренко ЛН. Эффектив­ность иммуномодулятора бластен в профилактике и лечении лучевой и химической цитосупрессии. Імунол та алергол 1999; (3): 54.
  7. Мосієнко ВС, Касяненко ІВ, Ганул ВЛ, Таруті-нов ВІ, Мосієнко МД, Савцова ЗД, Бендюг ГД, Півнюк ВМ, Зінєвич ОК, Смоланка II, Шинкарен­ко ЛМ. Бластен — новий імуномодулятор бактеріально­го походження. В: Імунотерапія при лікуванні злоякіс­них новоутворень. Матеріали наук-практ конф. Київ, 1998: 83-8.
  8. Белокрылов ГА, Попова ОЯ, Деревинна ОН, Молчанова ИВ. Неоднозначность действия больших и малых доз аминокислотных препаратов на иммунный ответ и фагоцитоз у мышей. Бюл. эксперим биологии и медицины 1994; (5): 500-2.
  9. Savtsova ZD, Voyejkova IM, Zauer NV, Zarit-skaya MY, Kovbasyuk SA, Yudina OYu, Indyk VM, Serkiz Y. Immunologically mediated effect of long-living radionuclides from a break-down ejection of the Ch.A.P.S. on experimental tumor process. Exp Oncol 1996; 18: 132-8.
  10. Yalkut SI, Baraboy VA, Zhukova VM, Zinchen­ko VA, Yudina OYu, Zauer NV, Kovbasyuk SA, Voyejkova. IM, Savtsova ZD. Influence of low molecular thymic factors on postradiation and chemically induced cytosuppression in experiment. Exp Oncol 1995; 17: 145-50.
  11. Лакин ГФ. Биометрия. Москва: Высш шк, 1980. 290 с.
  12. Hill DA. А review of cyclophosphamide. Illinois: Springerfield, USA, 1975. 341 p.
  13. Клиническая иммунология. Руководство для вра­чей. ЕИ Соколова, ред. Москва: Медицина, 1998. 272 с.
  14. Duhrsen U, Villeval J-L, Boyd J, Kannourakis G. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimu­lating factor on hematopoietic progenitor cells in cancer patients. Blood 1988; 72: 2074-81.
  15. Armitage JO. Emerging applications of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Blood 1998; 92: 4491-508.
  16. Hohaus S, Goldschmidt H, Ehrhardt R, Hass R. Successful autografting following myeloablative conditioning therapy with blood stem cells mobilized by chemotherapy plus rhG-CSF. Exp Haematol 1993; 21: 508-14.
  17. Beatty PG, Clift RA, Mickelson EM. Marrow transplantation from related donors other than H LA- identical siblings. N Engl J Med 1985; (313): 765-71.
  18. Долгополов ИС, Менткевич ГЛ. Современное состояние проблемы лечения детей с онкологическими заболеваниями с неблагоприятным прогнозом. Онко­логия 2000; 2: 207-11.
  19. Черданцева НВ, Кокорев ОВ, Коновалова НП, Кагия ВТ. Усиление цитотоксической и цитостатической активности спленоцитов и макрофагов радиосенсибилиза­тором АК-2123 у мышей с карциномой Льюис при тера­пии циклофосфаном. Эксперим онкол 1997; 19: 333-7.

 

Оставить комментарий

  Подписаться  
Уведомление о