Влияние иммуномодулятора из lactobacillus Delbrueckii на терапевтическую эффективность Циклофосфамида у мышей с карциномой льюис
EFFECT OF IMMUNOMODULATOR FROM
LACTOBACILLUS DELBRUECKII ON THERAPEUTIC EFFICACY
OF CYCLOPHOSPHAMIDE IN MICE WITH LEWIS CARCINOMA
T.A. Meniok, I.M. Voyejkova, O.Y. Yudina,
V.5. Mosienko, L.N. Shynkarenko, Z.D. Savtsova*
R.E. Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology,
National Academy of Sciences of Ukraine, 03022, Kyiv, Ukraine
ВЛИЯНИЕ ИММУНОМОДУЛЯТОРА ИЗ LACTOBACILLUS
DELBRUECKII НА ТЕРАПЕВТИЧЕСКУЮ ЭФФЕКТИВНОСТЬ
ЦИКЛОФОСФАМИДА У МЫШЕЙ С КАРЦИНОМОЙ ЛЬЮИС
Т.А. Менек, И.М. Воейкова, О.Ю. Юдина,
В.С. Мосиенко, Л.Н. Шинкаренко, З.Д. Савцова*
Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии
им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев, Украина
Results of investigation of peripheral blood, lymphoid organs, and intestinal epithelium showed that blasten (immunomodulator from Lactobacillus Delbrueckii) was capable of preventing cyclophosphamide-induced cytosuppression. Moreover, blasten augmented the therapeutic efficacy of cyclophosphamide in mfce with Lewis carcinoma. This augmentation manifested itself both in an enhanced tumor growth inhibition and in a lower metastasizing.
Key Words: immunomodulator from Lactobacillus Delbrueckii, Lewis lung carcinoma, cyclophosphamide, cytosuppression, therapeutic effect.
Результаты исследования периферической крови, лимфоидных органов, кишечного эпителия свидетельствуют о том, что иммуномодулятор из Lactobacillus Delbrueckii (бластен) эффективно предотвращает цитосупрес- сивное действие циклофосфамида. Кроме того, применение исследуемого препарата повышало терапевтическую эффективность циклофосфамида у мышей с карциномой легких Льюис, что проявлялось как в усилении торможения роста опухоли, так и в снижении метастазирования.
Ключевые слова: иммуномодулятор из Lactobacillus Delbrueckii, карцинома легких Льюис, циклофосфамид, цитосупрессия, терапевтический эффект.
Received: September 14, 2000.
Correspondence. Fax: (380-44) 267-1656; E-mail: savtsova@onconet.kiev.ua Используемые сокращения: ИИМ — индекс ингибиции метастазирования; ИМП — иммуномодулятор микробного происхождения; НСТ-тест — тест определения активности моноцитов с помощью гистохимического красителя — нитросинего тетразолия; ФНО — фактор некроза опухоли; ЦПА — цитохимический показатель активности; ЦФ — циклофосфамид. |
Несмотря на постоянное совершенствование средств и методов поддерживающей (сопровождающей) терапии, цитосупрессия, индуцированная облучением и/или химиотерапевтическими препаратами, продолжает оставаться серьезной проблемой, ограничивающей эффективность комбинированного и комплексного лечения больных онкологического профиля [1]. Наряду со специфическими кроветворными (колониестимулирующими) ростовыми факторами в качестве средств поддерживающей терапии внимание исследователей продолжают привлекать также неспецифические вещества,
которые могут стимулировать механизмы физиологической защиты системы гемо-, иммунопоэза от цитотоксических влияний, в частности, активировать индукцию ФНО, ИЛ-1 и ИЛ-6 – цитокинов, которые запускают “цитокиновый каскад”. Это обеспечивает защиту кроветворных клеток, обновление пула стволовых клеток, мобилизацию пула дозревающих и резервных клеток костного мозга, восстановление количества циркулирующих клеток периферической крови [2]. В последнее время в качестве неспецифических средств коррекции цитосупрессии все более активно исследуются препараты природного происхождения: пробиотики, продукты синтеза микроорганизмов-симбионтов, фитопрепараты, эмбриональные экстракты [3].
Как показали доклинические исследования нового иммуномодулятора из Lactobacillus Delbrueckii (бластен, НПЦ Энзифарм, Украина) [4], этот препарат достаточно эффективно стимулирует in vitro и in vivo продукцию моноцитами ФНО и ИЛ-1, способствует восстановлению гемопоэза при фракционированном гамма-облучении [5,6]. Положительное влияние препарата на содержание лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови было обнаружено и при проведении 1-Н фазы клинических испытаний при лучевой, химиолучевой и комбинированной химиотерапии больных раком молочной железы или раком легкого (II, III, IV стадии заболевания) [7].
Показано, что высокие и низкие дозы многих иммуномодуляторов по-разному влияют на популяции моноцитов и лимфоцитов [8]. Известно также, что при использовании иммуномодуляторов в высоких дозах (как разовых, так и суммарных при многократном частом введении) фаза гиперактивации иммунных реакций может сменяться их резким снижением (по сравнению даже с исходным уровнем) [5]. Учитывая это, задачей данного исследования явилось экспериментальное обоснование оптимальных доз и схем применения ИМП как препарата сопровождения при химиотерапии злокачественных опухолей.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ
Изучение влияния ИМП на химически индуцированную цитосупрессию проведено на мышах линии С57В1. Методом случайной выборки животных разделили на 4 группы: 1 -я — контрольная (интактные мыши), 2-я — мыши, которым внутрибрюшинно вводили ЦФ в дозе 200 мг/кг;
3-4-я — животные, которые за 1-2 ч до введения ЦФ получали ИМП (внутрибрюшинно) в дозах 6,7 и 0,07 мг/кг соответственно.
Через 10 сут у животных каждой группы определяли количество эритроцитов и лейкоцитов в периферической крови, число клеток в лимфоидных органах, субпопуляционный состав лимфоцитов в периферических лимфоузлах, количество макрофагов, выделенных по стандартной методике из брюшной полости, и их активность в НСТ-тесте [9]. Также исследовали митотическую активность эпителия крипт тонкого кишечника мышей каждой группы [10]. Математическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента [11].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Введение ЦФ не вызывало существенных изме-нений эритропоэза, но приводило к статистически достоверному (Р < 0,05) снижению таких показате-лей лейко- и иммунопоэза, как количество лейко-цитов в периферической крови; количество клеток в вилочковой железе и в периферических лимфо¬узлах; количество лимфоцитов на 1 мг массы этих органов и селезенки. Относительное содержание зрелых Т-лимфоцитов в периферических лимфо¬узлах снижалось, а относительное содержание зре¬лых B-лимфоцитов имело тенденцию к повышению (Р = 0,05). Относительное содержание бластов и больших лимфоцитов существенно возрастало, что можно трактовать как компенсаторную реакцию иммунной системы на лимфотоксическое воздей-ствие ЦФ [12]. Абсолютное содержание в перифе-рических лимфоузлах зрелых лимфоцитов было существенно сниженым, что отражает токсичность ЦФ для Т — (супрессоры, хелперы, цитотоксические лимфоциты), В-, ЕК-клеток [12, 13] и может нега¬тивно влиять на интенсивность противоопухолевых иммунных реакций. Отмечена тенденция к умень-шению количества макрофагов, однако их жизне-способность была достоверно сниженой. Активность в НСТ-тесте после воздействия ЦФ практически не изменялась (табл. 1).
Таблица 1. Влияние ИМП на некоторые показатели мышей линии С57В1, получавших ЦФ (200 мг/кг)
Показатель | Группа животных | |||
Интактный контроль | Контроль ЦФ | ИМП (6,7 мг/кг) + ЦФ | ИМП (0,07 мг/кг) + ЦФ | |
Количество лейкоцитов в крови (*106/мл) | 13,80 ±1,30 | 8,50 ± 2,001 | 10,20 ±2,20 | 11,60 ±2,50 |
*Количество клеток (* 106) в: | ||||
вилочковой железе | 74.30 ± 20.40
2,40 ± 0,20 |
19.00 ± 6.002
1,40 ± 0,301 |
19.20 ±3.402
1,60 ±0,101 |
21.80 ± 7.502
1,20 ±0,101 |
селезенке | 107,70 ±20,10
1,54 ±0,05 |
127,30 ±27,50
0,97 ± 0,071 |
199,30 ± 0,701, 3
0,96 ±0,101 |
247,30 ± 15,101,3,5
1,20 ±0,051,3,5 |
лимфатических узлах | 8.40 ±1,00
0,70 ± 0,07 |
4,10±0,201
0,40 ± 0,03 |
11.30 ± 2.303
0,50 ± 0,031 |
9.80 ± 2.604
0,40 ± 0,051 |
** Содержание в лимфатических узлах: | ||||
Т-лимфоцитов | 74,00±2,31
6,21±0,60 |
67,30 ±1.091
2,75 ± 0,401 |
Не иссл. | 69.70 ± 2.83
6,83 ± 0,283 |
В-лимфоцитов | 22,50±2,08
1,82±0,15 |
27,20 ±1,45
1,12 ± 0,202 |
Не иссл. | 24,30 ±1,86
2,38 ± 0,283 |
бластов и больших лимфоцитов | 2,80±0,60
0,24±0,5 |
4.80 ± 0.441
0,20 ± 0,02 |
Не иссл. | 4.50 ± 0.872
0,44 ± 0,083 |
Характеристики макрофагов: | ||||
общее количество (*106) | 4,50±1,70 | 1,20 ±0,40 | 0,90 ± 0,202 | 1,70 ±0,205 |
% жизнеспособных клеток | 96,70±0,50 | 86,30 ± 0,601 | 84,20 ± 4,001 | 91,60 ± 2,604
|
ЦПА (%) | 5,00±0,58 | 6,00 ±1,15 | 4,70 ± 0,67 | 4,00 ±1,00 |
Митотический индекс клеток кишечного эпителия (%) | 4,50±0,40 | 1,90 ±0,301 | 4,00 ± 0,904 | 3,50 ± 0,503 |
1 2 Р < 0,05; 0,05 < Р < 0,1 соответственно при сравнении с интактным контролем;
3 4 Р < 0,05; 0,05 < Р < 0,1 соответственно при сравнении с контролем ЦФ;
5 6 Р < 0,05; 0,05 < Р < 0,1 соответственно при сравнении групп животных, получавших ИМП в разных дозах;
* в числителе — количество клеток на орган, в знаменателе – количество клеток на 1 мг массы органа;
** в числителе — относительное содержание лимфоцитов разных субпопуляций (%), в знаменателе — абсолютное содержание лимфоцитов разных субпопуляций (106).
Введение ИМП предотвращало уменьшение количества лейкоцитов в периферической крови, уменьшало проявление лимфотоксического дей ствия ЦФ, способствовало усилению компенсаторно-восстановительных реакций организма. Проявлением последних является, в частности, стимуляция миграции лимфоцитов в периферические лимфоидные органы: в лимфатических узлах количество клеток практически не отличалось от аналогичного показателя у интактных мышей, в селезенке — превышало таковой. Относительное и абсолютное число зрелых Т- и В-лимфоцитов в периферических лимфоузлах не отличалось от нормальных показателей, что свидетельствовало о положительном влиянии ИМП на восстановление Т- и В-звеньев системы иммунитета. Повышение не только относительного, но и абсолютного содержания в лимфоузлах бластов и больших лимфоцитов является еще одним свидетельством высокого уровня компенсаторной реакции организма животных 3-й и 4-й групп. У мышей, которым вводили 6,7 мг/кг ИМП, количество макрофагов, выделяемых из брюшной полости, и их жизнеспособность оставались сниженными. Введение ИМП в дозе 0,07 мг/кг предотвращало снижение жизнеспособности макрофагов. Таким образом, приведенные результаты свидетельствуют, что ИМП из Lactobacillus Delbrueckii может эффективно корректировать негативное влияние химических цитостатиков на гемо- и иммунопоэз.
Введение ЦФ приводило также к существенному снижению митотического индекса клеток кишечного эпителия, что является одним из типичных проявлений побочного (органотоксического) действия цитостатиков (см. табл. 1). При введении ИМП в обеих исследуемых дозах и ЦФ митотический индекс клеток кишечного эпителия практически не отличался от такового у интактных мышей. Таким образом, ИМП из Lactobacillus Delbrueckii защищает не только от миелотоксического, но и от органоцитотоксического действия ЦФ, в частности, снижает негативное влияние последнего на митотическую активность (восстановление) клеток кишечного эпителия. Последнее обстоятельство представляется особенно важным, поскольку сегодня, благодаря открытию, разработке и внедрению в клинику рекомбинантных КСФ человека [14, 15], аутотрансплантации стволовых гемопоэтических клеток периферической крови [16], развитию аллогенной трансплантации клеток костного мозга [17] можно устранить гематологическую токсичность химиотерапии, однако органотоксичность или прямое цитотоксическое действие последней на организм больного остаются основными дозоли— митирующими факторами при назначении интенсивной и высокодозовой терапии [18].
Известно, что практически все противоопухолевые препараты негативно влияют на систему иммунитета (хотя механизмы такого влияния и клетки-мишени для препаратов разных групп могут варьировать) [1].
Особо следует подчеркнуть, что весьма чувствительной к большинству химиопрепаратов, в том числе и к ЦФ, является популяция ЕКК [13]. Снижение активности этих клеток может сопровождаться усилением метастазирования, что практически перечеркивает эффективность специфической противоопухолевой терапии.
Учитывая изложенное, а также выявленную возможность как положительной, так и отрицательной модуляции активности ЕКК при применении разных доз и схем введения ИМП [5], представлялось целесообразным изучить его влияние на противоопухолевую эффективность ЦФ на экспериментальной модели метастазирующей опухоли — карциномы легких Льюис. Исследование проведено на мышах линии C57BI, которых после перевивки опухолевых клеток делили на 4 группы: 1-я – мыши, которым вводили ЦФ (60 мг/кг) внутрибрюшинно на 3-и и 7-е сутки после перевивки опухоли;
2-я — мыши, которые получали ЦФ по такой же схеме и трехкратно (на 3-и, 7-е, 11 -е сутки внутрибрюшинно) — ИМП в дозе 6,7 мг/кг; 3-я — мыши, получавшие по аналогичным схемам ЦФ и ИМП в дозе 0,09 мг/кг; 4-я — животные, которым на 3-и, 7-е, 11 -е сутки вводили внутрибрюшинно изотонический раствор натрия хлорида в тех же объемах (0,2 мл) — контроль. Животным 2-й и 3-й групп ИМП вводили за 30 мин до ЦФ. На 27-е сутки оценивали торможение роста первичных опухолей, частоту и интенсивность метастазирования, а также рассчитывали ИИМ [19].
Установлено, что ЦФ в низкой терапевтической дозе (60 мг/кг) ингибирует рост первичных опухолей на 24%, а метастазирование — на 51%, при этом частота метастазирования и его интенсивность снижались в сравнении с контролем в 1,4 раза (табл. 2). Совместное применение ЦФ и ИМП в дозе 6,7 мг/кг повышало терапевтический эффект: торможение роста опухоли составило 60%, ИИМ — 61%. При использовании ИМП в дозе 0,09 мг/кг эффект был еще более выражен: торможение роста опухоли — 70%, ИИМ — 71%.
Таким образом, совокупность полученных данных обосновывает целесообразность использования иммуномодулятора из Lactobacillus Delbrueckii в качестве препарата сопровождения при химиотерапии злокачественных опухолей, причем оптимальными оказались его сверхнизкие дозы (0,07-0,09 мг/кг).
Таблица 2. Влияние комбинированной терапии ЦФ и ИМП на рост и метастазирование карциномы Льюис у мышей линии С57В1
Препарат | Доза, мг/кг | Торможение роста опухоли, % | Частота метастазирования, % | Среднее количество метастазов на мышь | ИИМ, % |
ЦФ | 60 | 24 | 60,0 | 9,0 ± 0,51 | 51 |
ЦФ+ИМП | 60+6,70 | 60 | 50,0 | 8,5± 0,51 | 61 |
ЦФ+ИМП | 60+0,09 | 70 | 44,4 | 7,1± 0,21,2 | 71 |
Контроль | ––– | 87,5 | 12,5± 1,2 | ––– |
1Р < 0,05 при сравнении с контролем;
2Р < 0,05 при сравнении с ЦФ.
ЛИТЕРАТУРА
- Касьяненко И.В. Химиотерапевтический метод лечения онкологических больных. В: Справочник по онкологии. Киев: Здоров’я, 2000: 66-76.
- Возианов А.Ф. Бутенко А.К. Зак К.П. Цитокины. Биологические и противоопухолевые свойства. Киев: Наук думка, 1998. 320 с.
- Руководство по иммунофармакологии. М.М. Дейл, Дж.К. Формен, ред. Москва: Медицина, 1998. 332 с.
- Патент 20509, А61К 35/74, С12 1/20. Біотехнологічний спосіб одержання імуномодулюючого препарату. Болоховська В.А. Волкова М.Ю. Воспяков В.Г. Даниленко В.С. Латишевська Г.В. Мартинюк Н.Б. Мосієнко В.С. Мосієнко М.Д. Савцова З.Д. Сойченко В.В. Шинкаренко Л.Б. Щеглова НА. — АТНБЦ “Ензифарм”, и А. — № 95083935; заявл 28.08.95.; публ 15.07.97.
- Мосієнко В.С. Мосієнко М.Д. Савцова З.Д. Даниленко В.С. Волкова М.Ю. Шинкаренко Л.М. Щеглова Н.А. Восп’яков В.Г. Свідро О.В. Меньок Т.А. Бластен – новий вітчизняний імуномодулятор біологічного походження. Журн АМН України 1999; 5: 79-86.
- Мосиенко ВС, Савцова ЗД, Менек ТА, Мосиенко МД, Касьяненко ИВ, Шинкаренко ЛН. Эффективность иммуномодулятора бластен в профилактике и лечении лучевой и химической цитосупрессии. Імунол та алергол 1999; (3): 54.
- Мосієнко ВС, Кас’яненко ІВ, Ганул ВЛ, Таруті-нов ВІ, Мосієнко МД, Савцова ЗД, Бендюг ГД, Півнюк ВМ, Зінєвич ОК, Смоланка II, Шинкаренко ЛМ. Бластен — новий імуномодулятор бактеріального походження. В: Імунотерапія при лікуванні злоякісних новоутворень. Матеріали наук-практ конф. Київ, 1998: 83-8.
- Белокрылов ГА, Попова ОЯ, Деревинна ОН, Молчанова ИВ. Неоднозначность действия больших и малых доз аминокислотных препаратов на иммунный ответ и фагоцитоз у мышей. Бюл. эксперим биологии и медицины 1994; (5): 500-2.
- Savtsova ZD, Voyejkova IM, Zauer NV, Zarit-skaya MY, Kovbasyuk SA, Yudina OYu, Indyk VM, Serkiz Y. Immunologically mediated effect of long-living radionuclides from a break-down ejection of the Ch.A.P.S. on experimental tumor process. Exp Oncol 1996; 18: 132-8.
- Yalkut SI, Baraboy VA, Zhukova VM, Zinchenko VA, Yudina OYu, Zauer NV, Kovbasyuk SA, Voyejko—va. IM, Savtsova ZD. Influence of low molecular thymic factors on postradiation and chemically induced cytosuppression in experiment. Exp Oncol 1995; 17: 145-50.
- Лакин ГФ. Биометрия. Москва: Высш шк, 1980. 290 с.
- Hill DA. А review of cyclophosphamide. Illinois: Springerfield, USA, 1975. 341 p.
- Клиническая иммунология. Руководство для врачей. ЕИ Соколова, ред. Москва: Медицина, 1998. 272 с.
- Duhrsen U, Villeval J-L, Boyd J, Kannourakis G. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on hematopoietic progenitor cells in cancer patients. Blood 1988; 72: 2074-81.
- Armitage JO. Emerging applications of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Blood 1998; 92: 4491-508.
- Hohaus S, Goldschmidt H, Ehrhardt R, Hass R. Successful autografting following myeloablative conditioning therapy with blood stem cells mobilized by chemotherapy plus rhG-CSF. Exp Haematol 1993; 21: 508-14.
- Beatty PG, Clift RA, Mickelson EM. Marrow transplantation from related donors other than H LA- identical siblings. N Engl J Med 1985; (313): 765-71.
- Долгополов ИС, Менткевич ГЛ. Современное состояние проблемы лечения детей с онкологическими заболеваниями с неблагоприятным прогнозом. Онкология 2000; 2: 207-11.
- Черданцева НВ, Кокорев ОВ, Коновалова НП, Кагия ВТ. Усиление цитотоксической и цитостатической активности спленоцитов и макрофагов радиосенсибилизатором АК-2123 у мышей с карциномой Льюис при терапии циклофосфаном. Эксперим онкол 1997; 19: 333-7.