Лиастен (Бластен) — новый отечественный иммуномодулятор биологического происхождения.

Журн. АМН України, 1999, т. 5, »6 1. — С. 79-86

УДК. 615.32:615.37

В. С. Мосієнко, М. Д. Мосієнко, 3. Д. Савцова, В. С. Даниленко, М. Ю. Волкова*, Л. М. Шинкаренко, Н. А. Щетлова, В. Г. Восп’яков, О. В. Свідро, Т. А.Меньок

БЛАСТЕН-НОВЫЙ ОТЕЧЕСТВЕННЫЙ ИММУНОМОДУЛЯТОР БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ.

(Представлено акад. НАН і АМН’України В. 6. Фролькісом)

Обобщены результаты  доклинического изучения оригинального лечебного препарата “Бластен”, который получен из клеточных стенок Lactobacillus Delbrueccii. Показано, что бластен является эффективным иммуномодулятором. Спектр иммуномодулирующих эффектов бластена включает в себя: влияние как на реакции специфического иммунитета, так и неспецифической резистентности организма. Показана дозозависимость влияния бластена на определенные части иммунной системы, а также отличия в динамике иммуномодуляции при использовании высоких (мг/кг) и низких (мкг/кг) доз.

Экспериментальными и клиническими исследованиями 70-80 –х годов убедительно показали, что нарушение иммунного состояния организма могут существенно влиять на эффективность и прогноз лечения. Для коррекции иммунного статуса достаточно широко используются иммуномодуляторы – средства, которые модифицируют иммунный ответ путем прямого влияния на иммунокомпетентные клетки или опосредованно через изменения разных биологических реакций организма. В качестве иммуномодуляторов используются структурные компоненты и продукты микроорганизмов, цитокины, аминокислотные препараты, синтетические соединения, минеральные вещества, комбинированные средства и др. До сегодняшнего времени механизмы действия большинства иммуномодуляторов  окончательно не установлены, но показано, что зависимость их эффекта от дозы часто не является линейной: наблюдается позитивная активность низких доз, средние не оказывают действия, а высокие оказывают противоположный эффект.

В связи с этим, дозы, режим введения и продолжительность курса лечения, сочетания иммуномодуляторов с другими методами и способами могут иногда быть решающими для получения требуемого терапевтического эффекта. Иммуномодуляторы, которые сегодня используются в клинике, в определенных случаях нарушают гомеостатическое равновесие систем организма, в частности иммунной и нейроэндокринной. Следствием этого, после кратковременной стимуляции клеточного иммунитета, может быть развитие его депрессии. Эффективность ряда иммуномодуляторов может сильно варьировать в зависимости от индивидуальной чувствительности. Наконец, иммуномодулирующий эффект может объединяться с цитопролиферативным влиянием препаратов на иммунокомпетентные клетки, что может повышать риск развития лейкозов.

В связи с этим актуальным заданием является поиск и изучение новых иммуномодуляторов, применение которых давало бы минимум побочных эффектов, стимулировало бы не только иммунные реакции, но и сбалансированность иммунной системы в целом и ее адаптационные возможности. В последнее время в качестве таких иммуномодуляторов все большее внимание исследователей уделяется препаратам пробиотического происхождения, которые оказывают благоприятное влияние на организм, стабилизируя и нормализуя функции как иммунной, так и других систем. Только в Европе выполняются 7 программ, которые направлены на разработку, изучение и использование для иммунокоррекции пробиотиков из лактобацилл. Аналогичные исследования проводятся в США, Канаде, Японии.

Авторами совместно с сотрудниками научно-биотехнологического центра ”Энзим” (Украина) разработан способ получения иммуномодулирующее препарата с клеточных стенок Lactobacillus Delbrueccii, которые получил название “Бластен”.

Целью работы было изучение спектра, дозозависимости и продолжительности иммуномодулирующих эффектов препарата “Бластен” для обоснования и разработки схем его использования в комплексном лечении разных заболеваний.

Материалы и методы.

При исследовании общефармакологической и специфической активности бластена , согласно требований и рекомендаций Фармакологического Комитета МЗ Украины [9] исследовали субстанцию препарата и готовую лекарственную форму, с наполнителем полиглюкином.

Исследования проводились на самцах и самках мышей линий А, СВА, С57ВІ/6, ВаІЬ/с, нелинейных ; крысах разводки вивария ИЭПОР НАН Украины; а также кролях обоих полов из вивария ИЭПОР.

Комплексное исследование препарата заключалось в определении по методу “Беренса” острой и хронической токсичности субстанции и ГЛЗ, а также изучение их влияния на серию показателей специфического и неспецифического иммунитета: Т-клеточность селезенки и периферических лимфоузлов; реакцию лимфоцитов , периферических лимфоузлов in vitro на митогены; количество антителобразующих клеток (АОК) в селезенке после иммунизации эритроцитами барана (определение по методу Эрне); титры антител в сыворотке крови после иммунизации эритроцитами барана или вирусами гриппа; реакцию гиперчувствительности замедленного типа к эритроцитами барана (РГЗТ); реакцию «трансплантант против хозяина» в сублетальных облученных реципиентах (РТПХ); цитотоксическую активность природных киллерных клеток (ПКК); активность перитонеальных макрофагов (по способности продуцировать in vitro фактор некроза опухоли).

Все иммунологические показатели определяли с помощью стандартных методов, детально описанных в литературе [2, 8, 9]. Математическую обработку проводили с использованием (t-критерия Стьюдента).

Для исследования влияния бластена на исследованные иммунологические характеристики использовался индекс модуляции (ИМ).

Результаты и их обсуждение.

Изучение острой токсичности субстанции бластена на нелинейных мышах и крысах выявило ее низкий уровень – при внутрибрюшинном введении ЛД50 составляла 6,7-7,2 г/кг массы тела. ЛД50 для самцов обоих видов были ниже, чем для самок. При курсовом парентеральном введении 4 доз субстанции животным трех видов не отмечено нарушений состояния внутренних органов, за исключением появления  отдельных  очагов реактивных изменений в лимфоидной ткани под влиянием наивысшей из курсовых доз. Раздражающий эффект, сенсибилизирующее действие, аллергическое действие и пирогенность также отсутствовали. Совокупность результатов позволила охарактеризовать бластен как практически неопасный препарат, которые не оказывает отрицательного воздействия на организм экспериментальных животных, а также не имеет тератогенного или эмбриотоксического действия. Изучение иммуномодулирующих возможностей бластена показало, что он активизирует широкий круг иммунологических реакций. При этом эффективные дозы ниже чем минимальные токсические дозы для мышей в 625-56200 раз, а для крыс – в 650-48500 раз. Терапевтический индекс  колебался от 1000 до 75000 независимо от состояния и вида животных. Важно, что существенную позитивную модуляцию специфической и неспецифической частей иммунной системы вызывали дозы препарата, которые практически не влияли на такие характеристики лимфоидной ткани как клеточность и пролиферативная активность. В исследованном диапазоне доз отмечается достаточно четкая дозозависимость отдельных иммуномодулирующих эффектов (таблица). Так через 5-7 дней после введения субстанции бластена наибольшее влияние на кооперативные реакции гуморального иммунитета (количество АУК, титры антител к гетероэритроцитам и к вирусу грипа) составляла доза 0,000013 ЛД50. Доза 0,001 ЛД50 вызывала в это время максимальное повышение индуцированной митогенами РБТЛ, РГУТ и продукции фактора некроза опухолей макрофагами, которые были дополнительно стимулированы in vitro.

Дозозависимость влияния бластена на индекс модуляции специфических и неспецифическихиммунологических показателей, %

Примечание: 1) в числителе – индексы модуляции, определенные в иследованиях на мышах линии СВА, которые характеризуются высоким уровнем реакции на введение эритроцитов барана, в знаменателе – индексы модуляции, определенные на мышах “низкореагирующей” на эритроциты барана линии С57ВL ; 2) в числителе – индексы модуляции продукции фактора некроза макрофагами без их дополнительной стимуляции in vitro; в знаменателе – индексы  модуляции продукции фактора некроза опухоли макрофагами, которые были дополнительно костимулированы липополисахаридом; * — Р< 0,05 по сравнению с абсолютными показателями контрольной группы.

Наивысшие показатели РТПХ и активности ПКК зафиксированы через 7 дней после использования 0,01 ЛД50 препарата. Однако последнюю дозу не следует необоснованно включать в “оптимальный диапазон”, так как она повышает (без дополнительного влияния антигенов или неспецифических митогенов) пролиферативную активность лимфоцитов, а также имеет как положительную, так и отрицательные фазы иммуномодулирующее влияния.

При изучении динамики модулирующего действия разных доз субстанции бластена на отдельные иммунологические показатели выявлено, что доза 0,01 ЛД50 вызывает через 2 суток усиление реакции лифоцитов периферических лифоузлов на митогены и увеличение активности макрофагов без дополнительной стимуляции ЛПС; через 5 дней отмечается повышение РГЗТ. Однако через 7-14 дней эти показатели уменьшаются до существенно более низких, чем в контроле. Динамика влияния ПКК аналогичная, однако несколько смещена во времени : существенное повышение через 7 дней , резкое падение через 14 дней. Наконец, позитивное влияние дозы 0,01 ЛД50 на формирование АОК к гетероэритроцитам не зафиксировано ни в одном из промежуток наблюдения. Наименьшая с изученных доз (0,000013 ЛД50) также повышала РБТЛ и РГЗТ, соответственно,через2 и 5 дней. В дальнейшем уровни этих реакций снижались, однако ни в одном из случаев не становились ниже, чем в контроле. Клеточность селезенки существенно не изменялась, хотя и отмечалась тенденция к ее повышению через 7 дней.  Относительное количество АОК к гетероэритроцитам , активность ПКК, а также активность макрофагов после влияния ЛПС постепенно выростали, и достигали максимума через 14 дней, то есть уменьшение дозы препарата позволило избежать фазы негативной модуляции иммунологических реакций при сохранении ммягкого позитивного влияния на иммунную систему.

Изучение дозозависимости и динамики иммуномодулирующего действия ГЛЗ “Бластена” подтвердило результаты, которые были получены при исследовании субстанции. Через 7-14 дней после одноразового парентерального введения ГЛЗ в дозах 0,05 и 0,01 ЛД50 отмечалось снижение, а в дозах 0,001, 0,0001, 0,00002, 0,000013 ЛД50 – стимуляция показателей гуморального и клеточного иммунитета. Максимальная и наибольшая продолжительностьи (до 4-5 недель) позитивной иммуномодууляции зарегистрировано после трехкратного подкожного введения ГЛЗ”Бластена” в дозе 0,000013 ЛД50 с интервалом 5-7 дней. Вместе с тем, широкий диапазон иммуномодулирующих влияний и эффективных доз указывает на возможность разработки разнообразных схем использования бластена , которые были бы оптимальными для конкретных иммунопатологических состояний и заболеваний.

Следовательно, высокие дозы(67-72 мг/кг) и низкие (0,06-0,09 мг/кг) дозы бластена имеют разное влияние на отдельные части иммунной системы и неодинаковую динамику иммуномодулирующих эффектов. Низкие дозы стимулируют ответ лимфоцитов  на митогены, кооперативные реакции специфического иммунитета и неспецифическую цитоктосичесность лимфоцитов, однако не влияют на активность моноцитов/макрофагов; ни в одном случае

Ни в одном из исследований не зафиксировано резких перепадов иммунологических параметров. Под влиянием высоких доз уже с 48 часов регистрируется стимуляция как специфического, так и неспецифического иммунитета, однако эта стимуляция носит транзиторный характер и сменяется затем падением исследуемых показателей ниже исходного уровня. неоднозначность действия разных доз бластена на лимфоцитв и макрофаги совпадает с данными про особенности влияния на эти клетки высоких и низких доз иммуномодуляторов другой группы – аминокислотных препаратов [2]. Это позволяет предположить, что выявленная дозозависимость основана скорее не на особенности собственно иммуномодулирующих препаратов, а на филогенетически определенных расождениях между лимфоцитами и макрофагами в чувствительности к экзогенным влияниям [12].

Сравнение бластена с ближайшим аналогом “Продигиозаном” (Россия) показало, что разработанный иммуномодулятор значительно эффективнее действуе на реакции клеточного иммунитета. После однократного введения рекаомендованных доз продигиозана стимуляция РГУТ не превышала 25%, стимуляция РТПХ – 50%. Оптимальные дозы бластена повышали показатели реакций в сравнении с контрольными, соответственно, на 40-45% и 70-100%. Кроме того, диапазон доз, которые являются эффективными в этих реакциях, у бластена значительно шире, чем у продигиозана (100-6000 мкг/кг и125-500 мкг/кг, соответственно). Последнее уменьшает опасность возникновения эффекта отмены иммуномодуляции при курсовом использовании или в связи с повышенной чувствительностью и особеностями индивидуального иммунного статуса организма.

Было также показано, что по способности стимулировать продукцию антител при иммунизации мышей бластен  в дозах 0,5-1,0 мг/кг не уступает полному адьюванту Фрейнда. Преимуществом бластена при этом является растворимость в физиологических растворах, в то время как адьювант Фрейнда эмульгируется в жировых растворителях. В 1996-1997 годах бластен успешно прошел І и II фазы клинических испытаний в комплексном лечении злокачественных новообразований, неспецифических бронхо-легочных заболеваний, гной хирургической инфекции и был рекомендован ФК МЗ Украины для промышленного производства и широкого внедрения в медицинскую практику.

Література

1. Актуальнью проблеми клинической иммунологни / Под ред. Г. Й. Моргуна, Р. В.. Петрова. — Итоги науки й техники. Сер. Иммунология. — М.: ВИНИТИ, 1588. — Т. 22. — 180 с. ,
2. Белокрилов Г. А.. Попова О. Я., Деревинна О. Н„ Молитва Й. В. Неоднознач-ность действия больших й мальїх доз аминокислотньїх препаратов на иммуннЬїй