ЛІАСТЕН (БЛАСТЕН) – НОВИЙ ВІТЧИЗНЯНИЙ ІМУНОМОДУЛЯТОР БІОЛОГІЧНОГО ПОХОДЖЕННЯ

Журн. АМН України, 1999, т. 5, «6 1. — С. 79-86

УДК. 615.32:615.37

В. С. Мосієнко, М. Д. Мосієнко, 3. Д. Савцова, В. С. Даниленко, М. Ю. Волкова*, Л. М. Шинкаренко, Н. А. Щетлова, В. Г. Восп’яков, О. В. Свідро, Т. А.Меньок

ЛІАСТЕН (БЛАСТЕН) – НОВИЙ ВІТЧИЗНЯНИЙ ІМУНОМОДУЛЯТОР БІОЛОГІЧНОГО ПОХОДЖЕННЯ

(Представлено акад. НАН і АМН України В. В. Фролькісом)

Узагальнено результати доклінічного дослідження оригінального лікувального препарату Ліастен (стара назва «Бластен»), отриманого з клітинних стінок Lactobacillus Delbrueccii. Показано, що «Ліастен» є ефективним імуномодулятором. Спектр імуномодулюючих ефектів «Ліастена» містить в собі: вплив як на реакції специфічного імунітету, так і неспецифічної резистентності організму. Показано дозозалежність впливу «Ліастена» на певні ділянки імунної системи, а також відмінності у динаміці імуномодуляції у разі використання високих (мг/кг) та низьких (мкг/кг) доз.

Експериментальними та клінічними дослідженнями 70-80-х років переконливо доведено, що порушення імунного стану організму можуть суттєво впливати на ефективність та прогноз лікування. Для корекції імунного статусу досить широко використовуються імуномодулятори – засоби, котрі модифікують імунну відповідь через прямий вплив на імунокомпетентні клітини, чи опосередковано – через зміни різних біологічних реакцій організму. У якості імуномодуляторів використовуються структурні компоненти та продукти мікроорганізмів, цитокіни, амінокислотні препарати, синтетичні сполуки, мінеральні речовини, комбіновані засоби та ін. До сьогодні, механізм дії більшості імуномодуляторів остаточно не встановлено, але показано, що залежність їх ефекту від дози часто не є лінійною: спостерігається позитивна активність низьких доз, середні не чинять дії, а високі дають протилежний ефект.

Через це, дози, режим введення та тривалість курсу лікування, поєднання імуномодуляторів з іншими методами та заходами, іноді можуть бути вирішальними для отримання очікуваного терапевтичного ефекту. Імуномодулятори, котрі сьогодні використовуються в клініці, за певних випадків порушують гомеостатичну рівновагу систем організму, зокрема – імунної та нейроендокринної. Наслідком цього, після короткочасної стимуляції клітинного імунітету, стає розвиток його депресії. Ефективність низки імуномодуляторів може сильно змінюватись в залежності від індивідуальної чутливості. До того ж імуномодулюючий ефект може поєднуватися з цитопроліферативним впливом препаратів на імунокомпетентні клітини, через що може підвищуватися ризик розвитку лейкозів.

У зв’язку з цим, актуальним завданням стає пошук та дослідження нових імуномодуляторів, застосування котрих давало б мінімум побічних ефектів, стимулювало б не тільки імунні реакції, а й збалансованість імунної системи взагалі, та її адаптаційні можливості. Останнім часом, як такі, імуномодулятори, все більше уваги дослідників привертають препарати пробіотичного походження, котрі чинять сприятливий вплив на організм, стабілізують і нормалізують функції як імунної, так і інших систем. Тільки в Європі виконуються 7 програм, котрі спрямовані на розробку, вивчення та використання для імунокорекції пробіотиків з лактобацил. Аналогічні дослідження проводять у США, Канаді, Японії.

Авторами, спільно зі співробітниками науково-біотехнологічного центру ”Ензим” (Україна), розроблено спосіб отримання імуномодулюючого препарату з клітинних стінок Lactobacillus Delbrueccii, котрий отримав назву «Ліастен» (Бластен).

Метою роботи було вивчення спектра, дозозалежності та тривалості імуномодулюючих ефектів препарату «Ліастен» для обґрунтування та розробки схем його використання у комплексному лікуванні різних захворювань.

Матеріали та методи.

При дослідженні загальнофармакологічної та специфічної активності «Ліастену», згідно з вимогами та рекомендаціями Фармакологічного Комітету МОЗ України [9], досліджували субстанцію препарату та готову лікарську форму, з наповнювачем поліглюкіном.

Дослідження проводилися на самцях та самках мишей ліній А, СВА, С57ВІ/6, ВаІЬ/с, нелінійних; на щурах розведення віварію ІЕПОР НАН України; а також на кролях обох статей із віварію ІЕПОР.

Комплексне дослідження препарату полягало у визначенні за методом “Беренса” гострої та хронічної токсичності субстанції та ГЛЗ, а також вивчення їх впливу на низку показників специфічного та неспецифічного імунітету: Т-клітинність селезінки та периферичних лімфовузлів; реакцію лімфоцитів, периферичних лімфовузлів in vitro на мітогени; кількість антитілоутворюючих клітин (АУК) у селезінці після імунізації еритроцитами барана (визначення за методом Ерне); титри антитіл у сироватці крові після імунізації еритроцитами барана або вірусами грипу; реакцію гіперчутливості сповільненого типу до еритроцитів барана (РГСТ); реакцію «трансплантат проти господаря» у сублетальних опромінених реципієнтах (РТПГ); цитотоксичну активність природних кілерних клітин (ПКК); активність перитонеальних макрофагів (за здатністю продукувати in vitro фактор некрозу пухлини).

Усі імунологічні показники визначали за допомогою стандартних методів, детально описаних у літературі [2, 8, 9]. Математичну обробку проводили з використанням (t-критерію Стьюдента).

Для дослідження впливу «Ліастена» на досліджувані імунологічні характеристики, використовувався індекс модуляції (ІМ).

Результати та їх обговорення

Вивчення гострої токсичності субстанції Ліастена на нелінійних мишах та щурах виявило низький її рівень – у разі внутрішньочеревного введення, ЛД50 складала 6,7-7,2 г/кг маси тіла. ЛД50 для самців обох видів були нижчими, ніж для самок. У разі курсового парентерального введення 4 доз субстанції тваринам трьох видів не відмічено порушень стану внутрішніх органів, за винятком появи окремих вогнищ реактивних змін у лімфоїдній тканині під впливом найвищої з курсових доз. Ефект подразнення, сенсибілізуюча дія, алергічна дія та пірогенність також були відсутні. Сукупність результатів дозволила охарактеризувати Ліастен, як практично безпечний препарат, котрий не чинить негативного впливу на організм експериментальних тварин, а також не має тератогенної чи ембріотоксичної дії. Вивчення імуномодулюючих можливостей Ліастена показало, що він активізує широке коло імунологічних реакцій.

При цьому ефективні дози нижчі за мінімальні токсичні дози для мишей у 625-56200 разів, а для щурів – у 650-48500 разів. Терапевтичний індекс коливався від 1000 до 75000 незалежно від стану та виду тварин. Важливо, що суттєву позитивну модуляцію специфічної та неспецифічної ланок імунної системи спричиняли дози препарату, котрі практично не впливали на такі характеристики лімфоїдної тканини як клітинність та проліферативна активність. У дослідженому діапазоні доз відзначається досить чітка дозозалежність окремих імуномодулюючих ефектів (таблиця). Так, через 5-7 днів після введення субстанції бластену, найбільший вплив на кооперативні реакції гуморального імунітету (кількість АУК, титри антитіл до гетероеритроцитів та вірусу грипу) чинила доза 0,000013 ЛД50. Доза 0,001 ЛД50, в той самий час спричиняла максимальне підвищення індукованої мітогенами РБТЛ, РГУТ та продукції фактора некрозу пухлин макрофагами, котрі були додатково стимульовані in vitro.

Дозозалежність впливу Ліастена на індекс модуляції специфічних та неспецифічних імунологічних показників, %

Примітка: 1) у чисельнику – індекси модуляції, визначені в дослідженнях на мишах лінії СВА, котрі характеризуються високим рівнем реакції на введення еритроцитів барана, у знаменнику – індекси модуляції, визначені на мишах “низькореагирующей” на еритроцити барана лінії С57;

2) у чисельнику – індекси модуляції продукції фактора некрозу макрофагами без їхньої додаткової стимуляції in vitro; у знаменнику – індекси модуляції продукції фактора некрозу пухлини макрофагами, котрих було додатково костимульовано ліпополісахаридом; * – Р<0,05 у порівнянні з абсолютними показниками контрольної групи.

Найвищі показники РТПГ та активності ПКК було зафіксовано через 7 днів після застосування 0,01 ЛД50 препарату. Однак останню дозу не слід необґрунтовано включати в “оптимальний діапазон”, оскільки вона підвищує (без додаткового впливу антигенів або неспецифічних мітогенів) проліферативну активність лімфоцитів, а також має як позитивну, так і негативні фази імуномодулюючого впливу.

При вивченні динаміки модулюючої дії різних доз субстанції Ліастена на окремі імунологічні показники, виявлено, що доза 0,01 ЛД50 спричиняє через 2 доби посилення реакції лімфоцитів периферичних лімфовузлів на мітогени та збільшення активності макрофагів без додаткової стимуляції ЛПС; через 5 днів відзначається підвищення РГСТ. Однак через 7-14 днів ці показники зменшуються до суттєво нижчих, ніж у контролі. Динаміка впливу ПКК аналогічна, проте дещо зміщена у часі: суттєве підвищення через 7 днів, різке падіння через 14 днів. Примітно, що позитивного впливу дози 0,01 ЛД50 на формування АУК до гетероеритроцитів не зафіксовано в жодному проміжку спостереження. Найменша з вивчених доз (0,000013 ЛД50) також підвищувала РБТЛ та РГСТ, відповідно через 2 і 5 днів. Надалі рівні цих реакцій знижувалися, проте в жодному випадку не ставали нижчими, ніж у контролі. Клітинність селезінки суттєво не змінювалася, хоч і відзначалася тенденція до її підвищення через 7 днів. Відносна кількість АУК до гетероеритроцитів, активність ПКК, а також активність макрофагів після впливу ЛПС поступово зростали і сягали максимуму через 14 днів, тобто зменшення дози препарату дозволило уникнути фази негативної модуляції імунологічних реакцій з одночасним збереженням м’якого позитивного впливу на імунну систему.

Вивчення дозозалежності та динаміки імуномодулюючої дії ГЛЗ “Ліастен” підтвердило результати, отримані під час дослідження субстанції. Через 7-14 днів після одноразового парентерального введення ГЛЗ у дозах 0,05 та 0,01 ЛД50, відмічалося зниження, а у дозах 0,001, 0,0001, 0,00002, 0,000013 ЛД50 – стимуляція показників гуморального та клітинного імунітету. Максимальну та найбільшу тривалість (до 4-5 тижнів) позитивної імуномодуляції, зареєстровано після триразового підшкірного введення ГЛЗ ”Ліастен” в дозі 0,000013 ЛД50 з інтервалом 5-7 днів. Разом з тим, широкий діапазон імуномодулюючих впливів та ефективних доз дає нам можливість для розробки різноманітних схем використання Ліастена, котрі були б оптимальними для конкретних імунопатологічних станів та захворювань.

Отже, високі дози (67-72 мг/кг) та низькі (0,06-0,09 мг/кг) дози Ліастена справляють різний вплив на окремі ланки імунної системи та неоднакову динаміку імуномодулюючих ефектів. Низькі дози стимулюють відповідь лімфоцитів на мітогени, кооперативні реакції специфічного імунітету та неспецифічну цитотоксичність лімфоцитів, проте не впливають на активність моноцитів/макрофагів в жодному з випадків.

Жодне з досліджень не зафіксовувало різких перепадів імунологічних параметрів. Під впливом високих доз вже після 48 годин реєструється стимуляція як специфічного, так і неспецифічного імунітету, проте ця стимуляція має транзиторний характер і змінюється потім падінням досліджуваних показників нижче за вихідний рівень. Неоднозначність дії різних доз бластена на лімфоцити та макрофаги збігається з даними щодо особливостей впливу на ці клітини високих та низьких доз імуномодуляторів іншої групи – амінокислотних препаратів [2]. Це дозволяє припустити, що виявлена ​​дозозалежність заснована швидше не на особливостях, власне, імуномодулюючих препаратів, а на філогенетично визначених розходженнях між лімфоцитами та макрофагами у чутливості до екзогенних впливів [12].

Порівняння Ліастена з найближчим аналогом “Продігіозаном” (Росія) показало, що розроблений імуномодулятор значно ефективніше діє на реакції клітинного імунітету. Після одноразового введення рекомендованих доз продігіозану, стимуляція РГСТ не перевищувала 25%, стимуляція РТПГ – 50%. Оптимальні дози бластену підвищували показники реакцій у порівнянні з контрольними, відповідно на 40-45% і 70-100%.

Крім того, діапазон доз, які виявляються ефективними у цих реакціях, у Ліастена значно ширший, ніж у продігіозану (100-6000 мкг/кг та 125-500 мкг/кг, відповідно). Завдяки цьому зменшується небезпека виникнення ефекту відміни імуномодуляції у разі курсового використання або через підвищену чутливість та особливості індивідуального імунного статусу організму.

Також було показано, що за здатністю стимулювати продукцію антитіл при імунізації мишей, Ліастен у дозах 0,5-1,0 мг/кг не поступається повному ад’юванту Фрейнда. Перевагою Ліастена є розчинність у фізіологічних розчинах, тоді як ад’ювант Фрейнда емульгується в жирових розчинниках. У 1996-1997 роках Ліастен успішно пройшов І та ІІ фази клінічних випробувань у комплексному лікуванні злоякісних новоутворень, неспецифічних бронхо-легеневих захворювань, гнійної хірургічної інфекції та був рекомендований ФК МОЗ України для промислового виробництва та широкого впровадження у медичну практику.

Література

1. Актуальные проблеми клинической иммунологии / Под ред. Г. Й. Моргуна, Р. В.. Петрова. — Итоги науки и техники. Сер. Иммунология. — М.: ВИНИТИ, 1588. — Т. 22. — 180 с. ,
2. Белокрылов Г. А.. Попова О. Я., Деревинна О. Н, Молитва Й. В. Неоднозначность действия больших и малых доз аминокислотных препаратов на иммунный ответ и фагоцитоз у мышей.// Бюл. эксперим. биологии и медицины — 1994. — № 5. — С. 500-501.